Απλοποιημένος έλεγχος μεμονωμένων βακτηριακών ειδών σε βιοδείγματα

Στην ιατρική έρευνα και τη διάγνωση, το μικροβίωμα, δηλαδή ο μικροβιακός αποικισμός του εντέρου, κερδίζει όλο και μεγαλύτερη προσοχή. Ένα δείγμα κοπράνων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ακριβή μελέτη του πολύπλοκου μικροβιακού οικοσυστήματος του εντέρου. Υπάρχουν δύο μέθοδοι για αυτό: η παραδοσιακή καλλιέργεια σε τρυβλία με συγκεκριμένα μέσα καλλιέργειας ή η σχετικά ακριβή ανάλυση DNA του δείγματος κοπράνων.

Και οι δύο μέθοδοι από μόνες τους δεν είναι ικανοποιητικές όταν πρόκειται για την ταχεία ανίχνευση ενός συγκεκριμένου βακτηριακού είδους στο δείγμα. Ερευνητές από την ερευνητική ομάδα εκπαίδευσης (RTG) Translational Evolutionary Research (TransEvo) στο Πανεπιστήμιο του Κιέλου (CAU) ανέπτυξαν μια γρήγορη και ισχυρή μέθοδο διαλογής για να εντοπίσουν και να καλλιεργήσουν ειδικά γαλακτοβάκιλλους, bifidobacteria και Bacteroides σε δείγματα κοπράνων.

Δημοσίευσαν τα αποτελέσματα στο περιοδικό Τρέχουσα Μικροβιολογία.

«Η μέθοδός μας είναι φθηνότερη και ταχύτερη από τις εναλλακτικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται συνήθως για την απομόνωση και τον εντοπισμό βακτηρίων σε πολύπλοκα μικροβιολογικά δείγματα», εξήγησε η πρώτη συγγραφέας Sofia Borges, Ph.D. φοιτητής στο Τμήμα Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας στο Max Rubner-Institut στο Κίελο. «Η μέθοδος είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για έλεγχο για ορισμένα βακτηριακά είδη για τα οποία δεν υπάρχει αποκλειστικό μέσο καλλιέργειας», πρόσθεσε ο καθηγητής Τσαρλς Φραντς, επικεφαλής του ινστιτούτου και αναπληρωτής καθηγητής στη Σχολή Γεωργικών και Διατροφικών Επιστημών στο Πανεπιστήμιο του Κιέλου.

«Με αυτή τη μέθοδο, εξοικονομούμε μακροχρόνιες διαδικασίες για την απομόνωση καθαρών βακτηριακών ειδών από δυνητικά ακάθαρτες αποικίες και την ταυτοποίησή τους».

Η βακτηριακή καλλιέργεια είναι συχνά μη επιλεκτική

Η βακτηριακή καλλιέργεια είναι η καλλιέργεια μικροοργανισμών σε ένα μέσο καλλιέργειας υπό ελεγχόμενες συνθήκες, όπως η θερμοκρασία. Το μέσο καλλιέργειας που επιλέγεται εξαρτάται από το είδος των βακτηρίων που αναζητάτε στο δείγμα. Τα επιλεκτικά μέσα ανάπτυξης προάγουν την ανάπτυξη συγκεκριμένων ειδών, ενώ αναστέλλουν την ανάπτυξη άλλων ειδών που περιέχονται στο δείγμα. Εάν το είδος που αναζητάτε είναι στο δείγμα, θα αναπτυχθεί σε μια αποικία.

Αυτό είναι το ιδανικό σενάριο. Ωστόσο, το μέσο καλλιέργειας συχνά δεν είναι αποκλειστικά επιλεκτικό μόνο για ένα είδος, αλλά επιτρέπει επίσης την ανάπτυξη πολλών άλλων βακτηριακών ειδών.

«Σε αυτή τη μελέτη, επικεντρωθήκαμε στα bifidobacteria, στους γαλακτοβάκιλλους και στα Bacteroides», είπε ο Borges. Τα Bifidobacteria και οι γαλακτοβάκιλλοι επιλέχθηκαν επειδή σχετίζονται με την υγεία του εντέρου, αλλά συνήθως δεν βρίσκονται σε μεγάλους αριθμούς στο έντερο. Επομένως, ακόμη και με μερικώς επιλεκτικά μέσα, μερικές φορές δεν είναι δυνατή η καλλιέργεια αυτών των βακτηρίων. Το Bacteroides συμπεριλήφθηκε στη μελέτη ως παράδειγμα ενός gram-αρνητικού είδους που σχετίζεται επίσης με την υγεία του εντέρου και μελετάται περαιτέρω από τους συν-συγγραφείς της μελέτης.

Ανίχνευση καθαρών αποικιών παρά την έλλειψη καθαρισμού

Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στην καλλιέργεια με χρήση τριών διαφορετικών επιλεκτικών μέσων, την εκχύλιση DNA, την ανάλυση PCR ενός συγκεκριμένου γονιδίου και την αλληλούχιση. Έξι δείγματα κοπράνων από υγιή άτομα χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμή αυτής της μεθόδου. Η καλλιέργεια γινόταν σε αναερόβιο θάλαμο (χωρίς οξυγόνο) για 48 ώρες στους 37 βαθμούς Κελσίου.

Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν καλά διαχωρισμένες μεμονωμένες αποικίες για βακτηριακή απομόνωση. Οι μεμονωμένες αποικίες αναλύθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μελέτης. Ήταν δυνατός ο εντοπισμός των βακτηριακών ειδών που περιέχονται και στις 180 αποικίες. Οι περισσότερες αποικίες μπορούν να εκχωρηθούν σε ένα μεμονωμένο είδος, ακόμη και αν τα επιλεγμένα μέσα που χρησιμοποιούνται όχι μόνο ευνοούν την ανάπτυξη των βακτηρίων-στόχων αλλά επιτρέπουν επίσης την ανάπτυξη πολλών άλλων ειδών.

“Ορισμένες από τις αποικίες μας περιείχαν έως και τρεις διαφορετικούς τύπους βακτηρίων. Ωστόσο, με έκπληξη διαπιστώσαμε ότι οι περισσότερες αποικίες ήταν καθαρές, παρά την ελάχιστη καλλιέργεια και κανένα καθαρισμό με επαναλαμβανόμενη αφαίρεση των αποικιών”, εξήγησε ο Μπόρχες.

Ο επικεφαλής της ομάδας εργασίας του Τσαρλς Φραντς συνόψισε τα εξής: “Η νέα μας μέθοδος καθιστά δυνατή την απόκτηση εικόνας για την καθαρότητα των αποικιών που υπάρχουν σε πλάκες άγαρ και τον ακριβή εντοπισμό των βακτηρίων που περιέχουν. Μπορεί επομένως να είναι χρήσιμη για την παροχή ενός γρήγορου, κόστους -αποτελεσματική και ισχυρή επισκόπηση των βακτηρίων που ανακτήθηκαν από πολύπλοκα μικροβιολογικά δείγματα πριν από την επιλογή τους για περαιτέρω μελέτη.”